Che cos'è HPLC — analisi?
La cromatografia liquida ad alte prestazioni si basa sul passaggio del campione attraverso una colonna impaccata sotto pressione con una fase mobile liquida. I componenti si muovono a velocità diverse a seconda della loro affinità con la fase stazionaria e lasciano la colonna in tempi diversi; vengono misurati con un rilevatore UV, DAD, a fluorescenza o ad indice di rifrazione.
Scopo di HPLC — analisi
Lo scopo è quello di separare composti termicamente labili o non volatili senza degradarli e di determinarne la quantità. Con questa tecnica vengono eseguiti l'analisi dei principi attivi e la profilazione delle impurità nei prodotti farmaceutici, nonché la determinazione degli additivi e delle vitamine negli alimenti.
A quali prodotti si applica HPLC — analisi?
- Principi attivi farmaceutici e prodotti finiti
- Additivi alimentari, conservanti e dolcificanti
- Preparati e integratori vitaminici
- Conservanti e filtri UV nei prodotti cosmetici
- Additivi polimerici e antiossidanti
In quali settori si utilizza HPLC — analisi?
Norme relative a HPLC — analisi
- Farmacopea Europea (Ph. Eur.) capitolo generale 2.2.29 — cromatografia liquida
- USP <621> (cromatografia)
- ICH Q2(R2) (convalida delle procedure analitiche)
- EN 12856 / EN 12857 (determinazione di edulcoranti e additivi negli alimenti)
Condizioni di HPLC — analisi
- Kolon
- Riempimento e dimensione definiti nello standard del metodo
- Hareketli faz
- Rapporto tampone/solvente organico definito nel metodo; isocratico o gradiente
- Lunghezza d'onda del rilevatore
- Viene specificato nel metodo in base al massimo assorbimento dell'analita
- Idoneità del sistema
- Criteri di solubilità, scodamento e riproducibilità definiti nella farmacopea
Apparecchiatura per HPLC — analisi
- Pompa ad alta pressione e unità di gradiente
- Campionatore automatico
- Forno a colonna e colonne analitiche
- Rivelatore UV/DAD/fluorescenza/RI
- Sistema di dati cromatografici
Requisiti del campione per HPLC — analisi
- Il campione deve essere reso solubile nella fase mobile
- È necessaria la filtrazione (generalmente 0,45 µm o inferiore) per prevenire l'intasamento della colonna
- La macinazione e l'estrazione vengono applicate per le forme di dosaggio solide
- La quantità di campione varia in base alla formulazione; in genere sono sufficienti pochi grammi
- Le informazioni sui principi attivi e sugli eccipienti devono essere condivise
Durata di HPLC — analisi
Una singola corsa dura generalmente dai 10 ai 60 minuti. Con i test di idoneità del sistema, la calibrazione e le iniezioni ripetute, la reportistica di routine richiede alcuni giorni lavorativi.
Procedura di HPLC — analisi
- 1Il campione viene sciolto, diluito e filtrato.
- 2Vengono preparati gli standard di calibrazione.
- 3Viene eseguito un test di idoneità del sistema e l'analisi non procede finché i criteri non vengono soddisfatti.
- 4Il campione viene iniettato nella colonna e il cromatogramma viene registrato.
- 5I picchi sono identificati dal tempo di ritenzione.
- 6Le aree dei picchi vengono valutate in base alla curva di calibrazione.
- 7Il risultato viene verificato con campioni di controllo qualità.
Criteri di accettazione di HPLC — analisi
Il contenuto di principi attivi e i limiti di impurità provengono dalla farmacopea o dal dossier di registrazione; negli alimenti e nei cosmetici si applica la relativa regolamentazione sugli additivi. Il metodo in sé non definisce un limite.
Valutazione dei risultati
I risultati vengono calcolati dalla curva di calibrazione. In un laboratorio in cui il metodo è stato validato, vengono stabiliti in anticipo la linearità, il recupero, la ripetibilità e il limite di quantificazione; il valore nel report è significativo all'interno di questo intervallo convalidato.
Rapporto di HPLC — analisi
- Descrizione del campione, data di ricevimento e numero di laboratorio
- Metodo applicato ed eventuale norma di riferimento
- Strumento e condizioni di misura
- Fasi di preparazione del campione
- Risultati e unità di misura
- Incertezza di misura (se richiesta)
- Una dichiarazione secondo cui i risultati si riferiscono solo al campione presentato per il test
Accreditamento
EUROLAB detiene un accreditamento riconosciuto a livello internazionale ottenuto da organismi di accreditamento parte degli accordi di riconoscimento multilaterale IAF e ILAC, secondo ISO / IEC 17025 per prove di laboratorio, ISO / IEC 17020 per ispezione e sorveglianza e ISO / IEC 17021-1 e ISO / IEC 17065 per certificazione di sistema e prodotto. Questa catena garantisce che i rapporti e i certificati emessi siano accettati in tutto il mondo.
Se questo test può essere offerto nell'ambito accreditato dipende dal prodotto e dallo standard applicato; poiché l'accreditamento è basato sul metodo, l'ambito viene confermato per iscritto in fase di offerta.
Ambito e autorizzazioniRegolamenti correlati
- Farmacopea Europea e monografie USP
- UE 1333/2008 (additivi alimentari)
- Regolamento Cosmetici UE 1223/2009
- ICH Q3A / Q3B (impurità)
Pagine in cui viene utilizzato questo metodo
Metodi analitici — Cosa fa questo gruppo di metodi?
La sezione seguente descrive l'ambito a cui appartiene la prova HPLC — analisi; le condizioni e i criteri di accettazione di questa prova specifica sono riportati nelle sezioni precedenti. L'ambito specifico del vostro prodotto viene confermato per iscritto in fase di offerta.
Le pagine sui metodi analitici sono pagine su una TECNICA DI MISURA piuttosto che su una prova. Questa differenza è importante: «prova alla nebbia salina» è una prova e risponde a una domanda; «ICP-MS» è una tecnica e viene utilizzata in decine di prove diverse. A volte l'utente non cerca la prova ma la tecnica, perché il nome del metodo è ciò che compare nella sua specifica.
Questa distinzione diventa decisiva nella scelta di un laboratorio. Quando un cliente chiede un'«analisi dei metalli pesanti», la vera domanda è con quale tecnica verrà eseguita: la XRF è rapida e non distruttiva ma non distingue i composti; l'AAS è economica per un singolo elemento; l'ICP-OES rileva più elementi; l'ICP-MS vede livelli in tracce. Lo stesso campione fornisce risultati con limiti di rilevazione e incertezze diverse tra le quattro tecniche.
La scelta del metodo avviene secondo tre criteri. LIMITE DI RILEVAZIONE: la concentrazione ricercata rientra nell'intervallo che il metodo può rilevare? COMPATIBILITÀ DI MATRICE: la matrice del campione (plastica, alimento, suolo, metallo) è una che il metodo può gestire, ed è richiesto un pretrattamento? LEGAME CON LA SPECIFICA: la norma di prodotto o la normativa impone un metodo particolare? Il terzo spesso prevale sui primi due — la specifica vincola il metodo.
Le pagine dei metodi creano una CATENA. Una tecnica è legata alle pagine di test in cui viene utilizzata, agli standard su cui si basano, alla legislazione a cui quegli standard sono legati e, in ultima analisi, ai regimi di accesso al mercato. La catena di esempio nel documento sorgente funziona in questo modo: XRF → analisi dei metalli → conformità RoHS → restrizione sui metalli pesanti → pagine di rivestimento. Qualunque sia il collegamento da cui accede l'utente, raggiunge gli altri.
In questa famiglia, la preparazione del campione rappresenta la metà invisibile del risultato ed è una fonte di errore maggiore della tecnica stessa. Il metodo di digestione, il grado di macinazione, il solvente di estrazione e il rapporto di diluizione modificano notevolmente il risultato. Lo stesso campione sullo stesso strumento dà un risultato diverso con una preparazione diversa; la definizione del metodo copre quindi anche la preparazione.
La calibrazione e la verifica sono il terzo componente determinante. Uno strumento viene calibrato con materiale di riferimento certificato, la curva di calibrazione viene verificata periodicamente e in ciascun lotto viene analizzato un campione di controllo. Senza questi passaggi un numero prodotto non è tracciabile anche se lo strumento funziona correttamente.
Gruppi di metodi in questo ambito
Analisi elementare
ICP-OES, ICP-MS, AAS e XRF. Differiscono nel limite di rilevamento, nella tolleranza della matrice e nella capacità multielemento.
Cromatografia
GC, GC-MS, HPLC, LC-MS/MS e cromatografia ionica. Separa una miscela nei suoi componenti e li misura separatamente.
Spettroscopia
FTIR, Raman, UV-Vis ed emissione ottica. Per l'identità del materiale, l'identificazione del gruppo funzionale e la composizione della lega.
Analisi termica
DSC, TGA, DMA e dilatometria. Temperature di transizione, composizione, decomposizione e comportamento dimensionale.
Microscopia e imaging
Microscopia ottica, SEM-EDS, radiografia e tomografia. Struttura, difetti e distribuzione degli elementi.
Chimica classica (per via umida)
Titolazione, gravimetria e colorimetria. Utilizzato come metodo di riferimento e per confermare i risultati strumentali.
Confusioni frequenti in questo ambito
- XRF è uno strumento di screening; vede gli elementi e non distingue i composti. Una decisione su un composto limitato richiede la conferma mediante chimica umida.
- L'espressione «non rilevato» non è prova di assenza; va letta insieme al limite di rilevazione del metodo.
- La specifica vincola il metodo. Un metodo tecnicamente migliore non viene accettato se la specifica ne richiede un altro.
- La preparazione del campione è parte del risultato; un verbale che non ne dichiari la preparazione non è riproducibile.
- I risultati ottenuti con tecniche diverse non possono essere confrontati direttamente; i loro limiti di rilevamento e le incertezze differiscono.
- Una pagina di metodo non è una pagina di test; quale metodo si applica a quale test deriva dalla norma di prodotto.
Quali decisioni supportano questi risultati
- Corrispondenza del metodo della specifica con l'ambito del laboratorio
- Scelta del metodo in base al limite di rilevamento e alla compatibilità della matrice
- Conferma di un risultato strumentale con un metodo di riferimento
- Eliminazione delle deviazioni dovute alla preparazione del campione
Test correlati
Domande frequenti su HPLC — analisi
Qual è la differenza tra HPLC e UPLC?
Il principio di base è lo stesso. UPLC funziona con un impaccamento di particelle più piccole e una pressione più elevata; la separazione viene completata più velocemente con picchi più netti. Il trasferimento è possibile se il metodo della farmacopea consente il cambio della colonna.
Perché è obbligatorio un test di idoneità del sistema?
Ciò dimostra che il sistema cromatografico, quel giorno con quella colonna, può raggiungere la separazione prevista. Un risultato ottenuto senza soddisfare i criteri non è accettato come valido.