¿Qué es HPLC — análisis?
La cromatografía líquida de alta resolución se basa en hacer pasar la muestra a través de una columna empaquetada a presión con una fase móvil líquida. Los componentes se mueven a diferentes velocidades según su afinidad por la fase estacionaria y abandonan la columna en diferentes momentos; se miden con un detector de UV, DAD, fluorescencia o índice de refracción.
Objetivo de HPLC — análisis
El objetivo es separar compuestos térmicamente lábiles o no volátiles sin degradarlos y determinar su cantidad. Con esta técnica se realizan análisis de ingredientes activos y perfiles de impurezas en productos farmacéuticos, y determinación de aditivos y vitaminas en alimentos.
¿A qué productos se aplica HPLC — análisis?
- Ingredientes activos farmacéuticos y productos terminados.
- Aditivos alimentarios, conservantes y edulcorantes.
- Preparados y suplementos vitamínicos.
- Conservantes y filtros UV en productos cosméticos.
- Aditivos poliméricos y antioxidantes.
¿En qué sectores se utiliza HPLC — análisis?
Normas relacionadas con HPLC — análisis
- Capítulo general 2.2.29 de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) — cromatografía líquida
- USP <621> (cromatografía)
- ICH Q2(R2) (validación de procedimientos analíticos)
- EN 12856 / EN 12857 (determinación de edulcorantes y aditivos en los alimentos)
Condiciones de HPLC — análisis
- Kolon
- Relleno y tamaño definidos en el método estándar.
- Hareketli faz
- Relación tampón/disolvente orgánico definida en el método; isocrático o gradiente
- Longitud de onda del detector
- Se especifica en el método según el máximo de absorción del analito.
- Idoneidad del sistema
- Criterios de solubilidad, cola y reproducibilidad definidos en la farmacopea.
Equipo para HPLC — análisis
- Bomba de alta presión y unidad de gradiente.
- Muestreador automático
- Horno de columnas y columnas analíticas.
- Detector UV / DAD / fluorescencia / RI
- Sistema de datos de cromatografía
Requisitos de muestra para HPLC — análisis
- La muestra debe hacerse soluble en la fase móvil.
- Se requiere filtración (generalmente 0,45 µm o menos) para evitar la obstrucción de la columna.
- La molienda y extracción se aplican para formas farmacéuticas sólidas.
- La cantidad de muestra varía según la formulación; unos pocos gramos son generalmente suficientes
- Se debe compartir la información sobre ingredientes activos y excipientes.
Duración de HPLC — análisis
Una sola ejecución suele durar entre 10 y 60 minutos. Con las pruebas de idoneidad del sistema, la calibración y las inyecciones repetidas, los informes de rutina tardan unos días hábiles.
Procedimiento de HPLC — análisis
- 1La muestra se disuelve, diluye y filtra.
- 2Se preparan estándares de calibración.
- 3Se realiza una prueba de idoneidad del sistema y el análisis no continúa hasta que se cumplan los criterios.
- 4La muestra se inyecta en la columna y se registra el cromatograma.
- 5Los picos se identifican por el tiempo de retención.
- 6Las áreas de los picos se evalúan según la curva de calibración.
- 7El resultado se verifica con muestras de control de calidad.
Criterios de aceptación de HPLC — análisis
El contenido de ingrediente activo y los límites de impurezas provienen de la farmacopea o del expediente de registro; en alimentos y cosméticos se aplica la normativa sobre aditivos correspondiente. El método en sí no define un límite.
Evaluación de resultados
Los resultados se calculan a partir de la curva de calibración. En un laboratorio donde el método ha sido validado, se establecen previamente la linealidad, la recuperación, la repetibilidad y el límite de cuantificación; el valor en el informe es significativo dentro de este rango validado.
Informe de HPLC — análisis
- Descripción de la muestra, fecha de recepción y número de laboratorio.
- Método aplicado y estándar de referencia, si lo hubiera.
- Condiciones del instrumento y de medición.
- Pasos de preparación de muestras
- Resultados de medición y unidades.
- Incertidumbre de medición (si se solicita)
- Una declaración de que los resultados se relacionan únicamente con la muestra enviada para la prueba.
Acreditación
EUROLAB posee una acreditación reconocida internacionalmente obtenida de organismos de acreditación que forman parte de los acuerdos de reconocimiento multilateral de IAF e ILAC, según ISO/IEC 17025 para pruebas de laboratorio, ISO/IEC 17020 para inspección y vigilancia, e ISO/IEC 17021-1 e ISO/IEC 17065 para certificación de sistemas y productos. Esta cadena garantiza que los informes y certificados emitidos sean aceptados en todo el mundo.
La posibilidad de ofrecer esta prueba dentro del alcance acreditado depende de su producto y del estándar aplicado; Dado que la acreditación se basa en métodos, el alcance se confirma por escrito en la etapa de cotización.
Alcance y autorizacionesRegulaciones Relacionadas
- Farmacopea Europea y monografías de la USP
- UE 1333/2008 (aditivos alimentarios)
- Reglamento sobre cosméticos UE 1223/2009
- ICH Q3A / Q3B (impurezas)
Páginas donde se utiliza este método
Métodos analíticos — ¿Qué hace este grupo de métodos?
La siguiente sección describe el campo al que pertenece el ensayo HPLC — análisis; las condiciones y criterios de aceptación de este ensayo en particular figuran en las secciones anteriores. El alcance específico de su producto se confirma por escrito en la etapa de cotización.
Las páginas de métodos analíticos son páginas sobre una TÉCNICA DE MEDICIÓN más que sobre un ensayo. Esta diferencia importa: «ensayo de niebla salina» es un ensayo y responde a una pregunta; «ICP-MS» es una técnica y se utiliza en decenas de ensayos distintos. A veces el usuario no busca el ensayo sino la técnica, porque el nombre del método es lo que aparece en su especificación.
Esta distinción se vuelve decisiva a la hora de elegir un laboratorio. Cuando un cliente pide un «análisis de metales pesados», la verdadera pregunta es con qué técnica se realizará: la XRF es rápida y no destructiva pero no distingue compuestos; la AAS es económica para un solo elemento; el ICP-OES detecta varios elementos; el ICP-MS ve niveles traza. La misma muestra da resultados con límites de detección e incertidumbres distintos en las cuatro técnicas.
La selección del método se realiza según tres criterios. LÍMITE DE DETECCIÓN: ¿está la concentración buscada dentro del rango que el método puede detectar? COMPATIBILIDAD DE MATRIZ: ¿es la matriz de la muestra (plástico, alimento, suelo, metal) una que el método pueda manejar, y se requiere pretratamiento? VÍNCULO CON LA ESPECIFICACIÓN: ¿exige la norma de producto o la legislación un método particular? El tercero suele prevalecer sobre los dos primeros: la especificación vincula el método.
Las páginas de métodos construyen una CADENA. Una técnica está vinculada a las páginas de prueba donde se utiliza, a las normas en las que se basan esas pruebas, a la legislación a la que están vinculadas esas normas y, en última instancia, a los regímenes de acceso a los mercados. La cadena de ejemplo en el documento fuente funciona así: XRF → análisis de metales → cumplimiento de RoHS → restricción de metales pesados → páginas de recubrimiento. Cualquiera que sea el enlace desde el que ingresa el usuario, llega a los demás.
La preparación de la muestra es la mitad invisible del resultado en esta familia y es una fuente de error mayor que la técnica misma. El método de digestión, el grado de molienda, el disolvente de extracción y la proporción de dilución modifican notablemente el resultado. La misma muestra en el mismo instrumento da un resultado diferente con una preparación diferente; Por lo tanto, la definición del método también incluye la preparación.
La calibración y la verificación son el tercer componente determinante. Se calibra un instrumento con material de referencia certificado, la curva de calibración se verifica periódicamente y se analiza una muestra de control en cada lote. Sin estos pasos, no se puede rastrear una cantidad producida incluso si el instrumento funciona correctamente.
Grupos de métodos en este campo
Análisis elemental
ICP-OES, ICP-MS, AAS y XRF. Se diferencian en el límite de detección, la tolerancia de la matriz y la capacidad de múltiples elementos.
Cromatografía
GC, GC-MS, HPLC, LC-MS/MS y cromatografía iónica. Separa una mezcla en sus componentes y mide cada uno por separado.
Espectroscopía
FTIR, Raman, UV-Vis y emisión óptica. Para identidad de materiales, identificación de grupos funcionales y composición de aleaciones.
Análisis térmico
DSC, TGA, DMA y dilatometría. Temperaturas de transición, composición, descomposición y comportamiento dimensional.
Microscopía e imagenología
Microscopía óptica, SEM-EDS, radiografía y tomografía. Estructura, defectos y distribución elemental.
Química clásica (húmeda)
Titulación, gravimetría y colorimetría. Se utiliza como método de referencia y para confirmar resultados instrumentales.
Confusiones frecuentes en este campo
- XRF es una herramienta de detección; ve elementos y no distingue compuestos. Una decisión sobre un compuesto restringido requiere confirmación mediante química húmeda.
- La expresión "no detectado" no es prueba de ausencia; se interpreta junto con el límite de detección del método.
- La especificación vincula el método. No se acepta un método técnicamente mejor si la especificación exige otro.
- La preparación de la muestra es parte del resultado; un informe que no indique la preparación no es reproducible.
- Los resultados obtenidos mediante diferentes técnicas no se pueden comparar directamente; sus límites de detección e incertidumbres difieren.
- Una página de método no es una página de prueba; qué método se aplica a qué prueba proviene de la norma del producto.
Qué decisiones respaldan estos resultados
- Correspondencia del método de la especificación con el alcance del laboratorio
- Selección del método según el límite de detección y la compatibilidad de la matriz
- Confirmación de un resultado instrumental con un método de referencia
- Eliminación de desviaciones derivadas de la preparación de la muestra
Pruebas relacionadas
Preguntas frecuentes sobre HPLC — análisis
¿Cuál es la diferencia entre HPLC y UPLC?
El principio básico es el mismo. UPLC opera con empaquetamiento de partículas más pequeñas y presión más alta; la separación se completa más rápido con picos más nítidos. La transferencia es posible si el método de la farmacopea permite un cambio de columna.
¿Por qué es obligatoria una prueba de idoneidad del sistema?
Demuestra que el sistema cromatográfico, ese día con esa columna, puede lograr la separación esperada. Un resultado obtenido sin cumplir los criterios no se acepta como válido.