ما هو HPLC — تحليل؟
يعتمد التحليل اللوني السائل عالي الأداء على تمرير العينة عبر عمود معبأ تحت ضغط مع طور متحرك سائل. تتحرك المكونات بسرعات مختلفة وفقًا لتقاربها مع الطور الثابت وتترك العمود في أوقات مختلفة؛ ويتم قياسها باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية أو DAD أو الفلورسنت أو كاشف معامل الانكسار.
الغرض من HPLC — تحليل
والغرض من ذلك هو فصل المركبات المتغيرة حرارياً أو غير المتطايرة دون تحللها وتحديد كميتها. يتم إجراء فحص المكونات النشطة وتحديد الشوائب في المستحضرات الصيدلانية، وتحديد المواد المضافة والفيتامينات في الأغذية باستخدام هذه التقنية.
على أي منتجات يُطبَّق HPLC — تحليل؟
- المكونات النشطة الصيدلانية والمنتجات النهائية
- المضافات الغذائية والمواد الحافظة والمحليات
- مستحضرات الفيتامينات والمكملات الغذائية
- المواد الحافظة ومرشحات الأشعة فوق البنفسجية في مستحضرات التجميل
- إضافات البوليمر ومضادات الأكسدة
في أي قطاعات يُستخدم HPLC — تحليل؟
المواصفات المتعلقة بـ HPLC — تحليل
- دستور الأدوية الأوروبي (Ph. Eur.) الفصل العام 2.2.29 — اللوني السائل
- USP <621> (الكروماتوغرافيا)
- ICH Q2(R2) (التحقق من صحة الإجراءات التحليلية)
- EN 12856 / EN 12857 (تقدير المحليات والمواد المضافة في الغذاء)
شروط HPLC — تحليل
- Kolon
- التعبئة والحجم المحدد في الطريقة القياسية
- Hareketli faz
- نسبة المذيبات العازلة/العضوية المحددة في الطريقة؛ إسقراطي أو متدرج
- الطول الموجي الكاشف
- يتم تحديده في الطريقة وفقًا للحد الأقصى لامتصاص المادة التحليلية
- ملاءمة النظام
- معايير الذوبان والمخلفات والتكاثر المحددة في دستور الأدوية
جهاز HPLC — تحليل
- مضخة الضغط العالي ووحدة التدرج
- أخذ العينات التلقائية
- فرن العمود والأعمدة التحليلية
- الأشعة فوق البنفسجية / DAD / مضان / كاشف RI
- نظام البيانات اللوني
متطلبات العينة لـ HPLC — تحليل
- يجب أن تكون العينة قابلة للذوبان في الطور المتحرك
- مطلوب الترشيح (عموما 0.45 ميكرومتر أو أقل) لمنع انسداد العمود
- يتم تطبيق الطحن والاستخلاص لأشكال الجرعات الصلبة
- تختلف كمية العينة حسب الصيغة؛ بضعة جرامات كافية بشكل عام
- يجب مشاركة معلومات العنصر النشط والسواغ
مدة HPLC — تحليل
تتراوح مدة الجري الفردي بشكل عام بين 10-60 دقيقة. ومع اختبارات ملاءمة النظام والمعايرة والحقن المتكرر، تستغرق التقارير الروتينية بضعة أيام عمل.
إجراء HPLC — تحليل
- 1يتم إذابة العينة وتخفيفها وتصفيتها.
- 2يتم إعداد معايير المعايرة.
- 3يتم إجراء اختبار ملاءمة النظام، ولا يستمر التحليل حتى يتم استيفاء المعايير.
- 4يتم حقن العينة في العمود ويتم تسجيل الرسم اللوني.
- 5يتم تحديد القمم من خلال وقت الاحتفاظ.
- 6يتم تقييم مناطق الذروة وفقًا لمنحنى المعايرة.
- 7ويتم التحقق من النتيجة باستخدام عينات مراقبة الجودة.
معايير قبول HPLC — تحليل
محتوى العنصر النشط وحدود الشوائب تأتي من دستور الأدوية أو ملف التسجيل؛ في المواد الغذائية ومستحضرات التجميل تنطبق اللائحة المضافة ذات الصلة. الطريقة نفسها لا تحدد الحد.
تقييم النتائج
يتم حساب النتائج من منحنى المعايرة. في المختبر حيث تم التحقق من صحة الطريقة، يتم تحديد الخطية والاسترداد والتكرار والحد الكمي مسبقًا؛ القيمة الموجودة في التقرير ذات معنى ضمن هذا النطاق الذي تم التحقق من صحته.
تقرير HPLC — تحليل
- وصف العينة وتاريخ استلامها ورقم المختبر
- الطريقة المطبقة والمعيار المرجعي، إن وجد
- شروط الصك والقياس
- خطوات تحضير العينة
- نتائج القياس والوحدات
- عدم اليقين في القياس (إذا طلب ذلك)
- إقرار بأن النتائج تتعلق فقط بالعينة المقدمة للاختبار
الاعتماد
حصلت EUROLAB على اعتماد معترف به دوليًا تم الحصول عليه من هيئات الاعتماد الأطراف في ترتيبات الاعتراف المتعددة الأطراف IAF وILAC، بموجب ISO/IEC 17025 للاختبارات المعملية، وISO/IEC 17020 للتفتيش والمراقبة، وISO/IEC 17021-1 وISO/IEC 17065 لشهادة النظام والمنتجات. تضمن هذه السلسلة قبول التقارير والشهادات الصادرة في جميع أنحاء العالم.
تعتمد إمكانية تقديم هذا الاختبار ضمن النطاق المعتمد على منتجك والمعيار المطبق؛ وبما أن الاعتماد يعتمد على الطريقة، يتم تأكيد النطاق كتابيًا في مرحلة عرض الأسعار.
النطاق والتفويضاتاللوائح ذات الصلة
- دستور الأدوية الأوروبي ودراسات USP
- الاتحاد الأوروبي 1333/2008 (المضافات الغذائية)
- الاتحاد الأوروبي 1223/2009 لائحة مستحضرات التجميل
- ICH Q3A / Q3B (الشوائب)
الصفحات التي يتم فيها استخدام هذه الطريقة
طرق التحليل — ماذا تفعل مجموعة الطرق هذه؟
يصف القسم أدناه المجال الذي ينتمي إليه اختبار HPLC — تحليل؛ أما شروط ومعايير قبول هذا الاختبار تحديدًا فترد في الأقسام أعلاه. يتم تأكيد النطاق الخاص بمنتجكم كتابيًا في مرحلة العرض السعري.
صفحات طرق التحليل هي صفحات عن تقنية قياس وليست عن اختبار. ويهم هذا الفرق: فـ«اختبار رذاذ الملح» اختبار يجيب عن سؤال واحد؛ أما «ICP-MS» فهي تقنية تُستخدم في عشرات الاختبارات المختلفة. وأحيانًا لا يبحث المستخدم عن الاختبار بل عن التقنية — لأن اسم الطريقة هو ما يظهر في مواصفته.
يصبح هذا التمييز حاسمًا عند اختيار المختبر. فعندما يطلب عميل «تحليل المعادن الثقيلة»، يكون السؤال الحقيقي هو بأي تقنية سيُجرى: فتقنية XRF سريعة وغير إتلافية لكنها لا تميز بين المركبات؛ وتقنية AAS اقتصادية لعنصر واحد؛ وتقنية ICP-OES تفحص عناصر متعددة؛ وتقنية ICP-MS ترى مستويات نزرة. وتُعطي العينة نفسها نتائج بحدود كشف ومستويات عدم يقين مختلفة عبر التقنيات الأربع.
يُختار الأسلوب وفقًا لثلاثة معايير. حد الكشف: هل يقع التركيز المطلوب ضمن النطاق الذي يستطيع الأسلوب رصده؟ توافق المصفوفة: هل مصفوفة العينة (بلاستيك، غذاء، تربة، معدن) من النوع الذي يستطيع الأسلوب التعامل معه، وهل تلزم معالجة مسبقة؟ الارتباط بالمواصفة: هل يفرض معيار المنتج أو التشريع أسلوبًا معينًا؟ وغالبًا ما يتغلب المعيار الثالث على الأولين — إذ تُلزم المواصفة بالأسلوب.
صفحات الطريقة تبني سلسلة. وترتبط التقنية بصفحات الاختبار التي تستخدم فيها، وبالمعايير التي تستند إليها تلك الاختبارات، وبالتشريعات التي ترتبط بها تلك المعايير، وفي نهاية المطاف بأنظمة الوصول إلى الأسواق. تعمل سلسلة الأمثلة في المستند المصدر على النحو التالي: XRF ← تحليل المعادن ← الامتثال لـ RoHS ← تقييد المعادن الثقيلة ← صفحات الطلاء. وأيًا كان الرابط الذي يدخل منه المستخدم، فإنه يصل إلى الآخرين.
يعد تحضير العينة هو النصف غير المرئي من النتيجة في هذه العائلة وهو مصدر خطأ أكبر من التقنية نفسها. طريقة الهضم ودرجة الطحن ومذيب الاستخلاص ونسبة التخفيف تغير النتيجة بشكل ملحوظ. نفس العينة على نفس الأداة تعطي نتيجة مختلفة مع إعداد مختلف؛ وبالتالي فإن تعريف الطريقة يشمل التحضير أيضًا.
المعايرة والتحقق هي العنصر المحدد الثالث. تتم معايرة الجهاز بمواد مرجعية معتمدة، ويتم التحقق من منحنى المعايرة بشكل دوري ويتم تشغيل عينة التحكم في كل دفعة. بدون هذه الخطوات، لا يمكن تتبع الرقم الناتج حتى لو كان الجهاز يعمل بشكل صحيح.
مجموعات الطرق في هذا المجال
التحليل العنصري
ICP-OES، ICP-MS، AAS وXRF. وهي تختلف في حد الكشف وتسامح المصفوفة وقدرة العناصر المتعددة.
الكروماتوغرافيا
GC، GC-MS، HPLC، LC-MS/MS واللوني الأيوني. فهو يفصل الخليط إلى مكوناته ويقيس كل منها على حدة.
التحليل الطيفي
FTIR، رامان، الأشعة فوق البنفسجية والبصرية. للهوية المادية وتحديد المجموعة الوظيفية وتكوين السبائك.
التحليل الحراري
DSC، وTGA، وDMA، وقياس التوسع. درجات الحرارة الانتقالية والتركيب والتحلل وسلوك الأبعاد.
المجهرية والتصوير
الفحص المجهري البصري، SEM-EDS، التصوير الشعاعي والتصوير المقطعي. الهيكل والعيوب والتوزيع العنصري.
الكيمياء الكلاسيكية (الرطبة)
المعايرة والجاذبية وقياس الألوان. تستخدم كوسيلة مرجعية وفي تأكيد النتائج المفيدة.
أمور يشيع الخلط بينها في هذا المجال
- XRF هي أداة فحص؛ فهو يرى العناصر ولا يميز المركبات. يتطلب اتخاذ قرار بشأن مركب مقيد تأكيدًا بواسطة الكيمياء الرطبة.
- عبارة «غير مكتشف» ليست دليلاً على الغياب؛ تُقرأ مع حد الكشف الخاص بالطريقة.
- المواصفات تربط الطريقة. لا يتم قبول الطريقة الأفضل من الناحية الفنية إذا كانت المواصفات تتطلب طريقة أخرى.
- إعداد العينة هو جزء من النتيجة؛ التقرير الذي لا يذكر التحضير غير قابل للتكرار.
- لا يمكن مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بتقنيات مختلفة مباشرة؛ تختلف حدود الكشف والشكوك.
- صفحة الطريقة ليست صفحة اختبار؛ ما هي الطريقة التي تنطبق على أي اختبار يأتي من معيار المنتج.
ما القرارات التي تدعمها هذه النتائج
- مطابقة الطريقة المذكورة في المواصفة مع نطاق المختبر
- اختيار الطريقة وفق حد الكشف وتوافق المصفوفة
- تأكيد النتيجة الآلية بطريقة مرجعية
- إزالة الانحرافات الناتجة عن تحضير العينة
الاختبارات ذات الصلة
الأسئلة الشائعة حول HPLC — تحليل
ما هو الفرق بين HPLC وUPLC؟
المبدأ الأساسي هو نفسه. تعمل UPLC بتعبئة جسيمات أصغر وضغط أعلى؛ يكتمل الانفصال بشكل أسرع مع قمم أكثر وضوحًا. يكون النقل ممكنًا إذا كانت طريقة دستور الأدوية تسمح بتغيير العمود.
لماذا يعتبر اختبار ملاءمة النظام إلزاميا؟
ويبين أن النظام الكروماتوغرافي، في ذلك اليوم مع ذلك العمود، يمكنه تحقيق الفصل المتوقع. لا يتم قبول النتيجة التي تم الحصول عليها دون استيفاء المعايير على أنها صالحة.