Endotoksin Testi — EP 2.6.14 / USP <85> / ANSI AAMI ST72 · İlaç ve Farmasötik Analiz

Endotoksin Testi (LAL) Nedir?

Endotoksin testi, Gram negatif bakterilerin hücre duvarından kaynaklanan lipopolisakkarit (endotoksin) miktarını ölçer. Endotoksin ısıya dayanıklıdır: sterilizasyon bakteriyi öldürür ama endotoksini yok etmez. Bu nedenle steril bir ürün bile pirojenik olabilir ve ayrıca test edilmesi gerekir.

Endotoksin Testi (LAL) Amacı

Amaç, kan dolaşımı, beyin omurilik sıvısı veya implant yoluyla vücuda temas eden cihazlardaki endotoksin düzeyinin izin verilen sınırın altında olduğunu göstermektir.

Endotoksin Testi (LAL) Hangi Ürünlere Uygulanır?

İntravenöz kateterler ve infüzyon setleri
İmplantlar
Diyaliz setleri
Cerrahi aletler ve setler
Beyin omurilik sıvısıyla temas eden cihazlar

Endotoksin Testi (LAL) Hangi Sektörlerde Kullanılır?

Medikal CihazSağlıkİlaç

Endotoksin Testi (LAL) İçin İlgili Standartlar

EP 2.6.14
USP <85>
ANSI/AAMI ST72
ISO 11737-3

Endotoksin Testi (LAL) Koşulları

Yöntem: Jel pıhtılaşma, turbidimetrik veya kromojenik LAL yöntemleri
Ekstraksiyon: Ürünün vücutla temas eden yüzeyleri endotoksinsiz su ile ekstrakte edilir
Girişim kontrolü: Ürünün testi baskılamadığı veya güçlendirmediği doğrulanmalıdır

Endotoksin Testi (LAL) Cihazı

LAL test kitleri ve reaktifleri
Endotoksinsiz cam malzeme
Mikroplaka okuyucu (kinetik yöntemler için)
Kuru ısı fırını (depirojenizasyon için)
Sıcaklık kontrollü inkübatör

Endotoksin Testi (LAL) İçin Numune Gereksinimleri

Nihai, sterilize edilmiş ürün
Vücutla temas eden yüzey alanı bilinmeli
Numune sayısı farmakope ve parti bilgisine göre belirlenir
Numune endotoksinsiz kaplarda hazırlanmalı ve taşınmalı

Endotoksin Testi (LAL) Süresi

Girişim (inhibisyon/güçlendirme) çalışması dâhil ilk test birkaç gün; rutin testler daha kısadır.

Endotoksin Testi (LAL) Prosedürü

1Ürün için endotoksin limiti hesaplanır.
2Girişim çalışması yapılır veya mevcut çalışmaya atıf verilir.
3Ürün endotoksinsiz su ile ekstrakte edilir.
4LAL reaktifi ile ekstrakt karıştırılır.
5Tanımlı sıcaklıkta inkübe edilir.
6Yönteme göre pıhtı oluşumu, bulanıklık veya renk gelişimi ölçülür.
7Standart eğri üzerinden endotoksin miktarı hesaplanır.

Endotoksin Testi (LAL) Kabul Kriterleri

Kabul kriteri, ürün için hesaplanan endotoksin limitidir. Bu limit, cihazın temas yolu ve hasta ağırlığı esas alınarak farmakopede tanımlı formülle hesaplanır; beyin omurilik sıvısıyla temas eden cihazlarda limit belirgin biçimde daha düşüktür.

Sonuçların Değerlendirilmesi

Sonuç hesaplanan limitle karşılaştırılır. Girişim çalışması geçerli değilse sonuç yorumlanamaz; ürünün LAL reaksiyonunu baskıladığı durumlarda seyreltme faktörü belirlenmelidir.

Endotoksin Testi (LAL) Raporu

Uygulanan farmakope ve yöntem
Numune tanımı, parti ve yüzey alanı
Hesaplanan endotoksin limiti
Girişim çalışması sonucu ve seyreltme faktörü
Ölçülen endotoksin değeri (EU/cihaz veya EU/mL)
Limit karşılaştırması

Akreditasyon

EUROLAB; laboratuvar deneylerinde ISO/IEC 17025, muayene ve gözetimde ISO/IEC 17020, sistem ve ürün belgelendirmesinde ISO/IEC 17021-1 ve ISO/IEC 17065 kapsamlarında, IAF ve ILAC çok taraflı tanınma anlaşmalarına taraf akreditasyon kuruluşlarından alınmış uluslararası tanınan akreditasyona sahiptir. Bu zincir, düzenlenen rapor ve belgelerin dünya genelinde kabul görmesini sağlar.

Bu testin akredite kapsamda sunulup sunulamayacağı ürününüze ve uygulanacak standarda göre değişir; akreditasyon metot bazında olduğu için kapsam teklif aşamasında yazılı olarak teyit edilir.

Kapsam ve yetkiler

İlgili Mevzuat

MDR (AB) 2017/745
Farmakope şartları

İlaç ve Farmasötik Analiz — Bu Deney Alanı Ne Yapar?

Aşağıdaki bölüm Endotoxin deneyinin ait olduğu alanı anlatır; bu deneyin kendi koşulları ve kabul ölçütleri yukarıdaki bölümlerde yer alır. Ürününüze özgü kapsam teklif aşamasında yazılı olarak netleştirilir.

Farmasötik analiz, ilaç etkin maddesinin ve bitmiş ürünün kimliğini, saflığını, miktarını ve davranışını belirler. Bu ailenin diğerlerinden ayrılan yönü, yöntemlerin büyük ölçüde FARMAKOPELERDE tanımlı olmasıdır: Avrupa Farmakopesi (Ph. Eur.) ve Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) hem yöntemi hem kabul çerçevesini birlikte verir.

Farmakope yönteminin bağlayıcılığı alanın çalışma biçimini belirler. Diğer sektörlerde laboratuvar uygun bir yöntem seçebilirken burada monografta yazan yöntem esastır; alternatif yöntem kullanılacaksa eşdeğerliğinin gösterilmesi gerekir. Bu, sonuçların dünya genelinde karşılaştırılabilir olmasını sağlar.

Analizler birkaç grupta yürütülür. Kimlik ve miktar tayini (HPLC, UV, titrasyon) ürünün ne olduğunu ve ne kadar etkin madde içerdiğini gösterir. Safsızlık profili ve kalıntı çözücüler, üretim sürecinden gelen istenmeyen bileşikleri arar. Element safsızlıkları katalizör ve ekipman kaynaklı metalleri ele alır. Çözünme ve dağılma davranışı, ilacın vücutta salınım davranışına ilişkin en önemli in vitro göstergedir.

ÇÖZÜNME DENEYİ alanın en kritik ölçümlerinden biridir. Bir tabletin doğru miktarda etkin madde içermesi yeterli değildir; o maddenin uygun hızda çözünmesi gerekir. Çözünme profili, formülasyon değişikliklerinin biyoyararlanıma etkisini değerlendirmede kullanılır ve jenerik ilaç ruhsatlandırmasında merkezî bir yer tutar.

YÖNTEM VALİDASYONU bu ailede zorunlu bir adımdır. Farmakope yöntemi kullanılıyorsa yöntemin o laboratuvarın koşullarında uygun çalıştığı doğrulanır. Kendi yöntemi geliştirilmişse doğrusallık, kesinlik, doğruluk, seçicilik, tespit ve tayin sınırı, sağlamlık gibi parametrelerle valide edilir. Valide edilmemiş bir yöntemle üretilen sonuç ruhsat dosyasında kullanılamaz.

Stabilite çalışmaları raf ömrünü belirler ve alanın en uzun süren işidir. Ürün tanımlı sıcaklık ve nem koşullarında bekletilir, belirli aralıklarla analiz edilir ve sonuçlar raf ömrü ile saklama koşulu iddiasının dayanağı olur. Hızlandırılmış koşullar ön bilgi verir ama gerçek zamanlı veri esastır.

Mikrobiyolojik taraf ayrı bir gövdedir: mikrobiyal yük sayımı, belirlenmiş mikroorganizmaların aranması, steril ürünlerde sterilite deneyi ve bakteriyel endotoksin deneyi. Steril ürünlerde ayrıca ambalaj bütünlüğü ve sterilizasyon validasyonu devreye girer.

Veri bütünlüğü (data integrity) son yıllarda denetimlerin merkezine yerleşti. Sonucun doğru olması yetmez; ham verinin izlenebilir, değiştirilemez ve denetlenebilir olması gerekir. Elektronik kayıt sistemlerinin doğrulanması bu yüzden analizin ayrılmaz parçası hâline geldi.

Bu alanın yöntem grupları

Kimlik ve miktar
HPLC, UPLC, UV-Vis spektrofotometri, titrasyon, FTIR ile kimlik doğrulama.
Safsızlık ve kalıntı
İlgili safsızlıklar, bozunma ürünleri, kalıntı çözücüler (GC-headspace), nitrozamin taramaları.
Element safsızlıkları
ICP-MS ve ICP-OES ile element safsızlık tayini ve risk değerlendirmesi.
Fizikokimyasal
Çözünme ve dağılma, sertlik, ufalanma, dozaj birimi tekdüzeliği, su içeriği (Karl Fischer), partikül boyutu.
Mikrobiyolojik
Mikrobiyal enumerasyon, belirlenmiş mikroorganizmalar, sterilite, bakteriyel endotoksin, koruma etkinliği.
Stabilite
Gerçek zamanlı ve hızlandırılmış stabilite çalışmaları; fotostabilite ve kullanım sırasında stabilite.

Bu alanda sık karıştırılanlar

Farmakope yöntemi bağlayıcıdır; alternatif yöntem ancak eşdeğerliği gösterilerek kullanılabilir.
Yöntem validasyonu olmadan üretilen sonuç ruhsat dosyasında kullanılamaz.
Hızlandırılmış stabilite gerçek zamanlı verinin yerini almaz; raf ömrü gerçek zamanlı sonuçla desteklenir.
Çözünme profili cihaz tipine, karıştırma hızına ve ortama duyarlıdır; koşullar raporda eksiksiz olmalıdır.
Veri bütünlüğü eksikliği, sonuç doğru olsa bile denetimde uygunsuzluk üretir.
Formülasyon ya da tedarikçi değişikliği analitik karşılaştırma ve gerekiyorsa yeni stabilite çalışması gerektirir.

Bu alandaki sonuçlar hangi kararı besler

Ruhsat dosyası ve parti serbest bırakma
Raf ömrü ve saklama koşulu belirleme
Yöntem transferi ve yöntem validasyonu
Tedarikçi hammadde kabul kontrolü
Formülasyon değişikliğinin biyoeşdeğerliğe etkisinin değerlendirilmesi

İlgili Testler

Endotoksin Testi (LAL) Hakkında Sık Sorulan Sorular

Ürünüm steril, endotoksin testi neden gerekiyor?

Endotoksin ısıya dayanıklıdır; sterilizasyon bakteriyi öldürse de hücre duvarı kalıntısı olan endotoksini parçalamaz. Bu nedenle steril bir ürün pirojenik reaksiyona yol açabilir ve endotoksin ayrıca ölçülmelidir.

Endotoksin limiti nasıl belirleniyor?

Farmakopede tanımlı formülle, cihazın temas yolu ve izin verilen doz esas alınarak hesaplanır. Beyin omurilik sıvısıyla temas eden cihazlarda limit çok daha düşüktür; hesaplama raporda gösterilmelidir.