ВЭЖХ-анализ

Что такое HPLC — анализ?

Высокоэффективная жидкостная хроматография основана на пропускании образца через насадочную колонку под давлением с жидкой подвижной фазой. Компоненты движутся с разной скоростью в зависимости от их сродства к неподвижной фазе и покидают колонну в разное время; они измеряются с помощью детектора УФ, ДАД, флуоресценции или детектора показателя преломления.

HPLC — анализ: цель

Целью является разделение термически нестабильных или нелетучих соединений без их разложения и определение их количества. С помощью этого метода выполняются анализ активных ингредиентов и определение профиля примесей в фармацевтических препаратах, а также определение добавок и витаминов в пищевых продуктах.

К каким изделиям применяется HPLC — анализ?

Фармацевтические активные ингредиенты и готовая продукция
Пищевые добавки, консерванты и подсластители
Витаминные препараты и добавки
Консерванты и УФ-фильтры в косметической продукции
Полимерные добавки и антиоксиданты

В каких отраслях применяется HPLC — анализ?

ХимияФармацевтикаПищевая продукцияКосметикаОкружающая средаБиотехнологияРозничная торговля

Стандарты, связанные с HPLC — анализ

Европейская фармакопея (Ph. Eur.), общая глава 2.2.29 — жидкостная хроматография
USP <621> (хроматография)
ICH Q2(R2) (валидация аналитических процедур)
EN 12856/EN 12857 (определение подсластителей и добавок в пищевых продуктах)

HPLC — анализ: условия

Kolon: Заливка и размер определены в стандарте метода.
Hareketli faz: Соотношение буфер/органический растворитель, определенное в методе; изократический или градиентный
Длина волны детектора: В методе указывается по максимуму поглощения аналита.
Пригодность системы: Критерии растворимости, разложения и воспроизводимости, определенные в фармакопее.

Оборудование для HPLC — анализ

Насос высокого давления и градиентный блок
Автосамплер
Колоночная печь и аналитические колонки
УФ/ДАД/флуоресцентный/РИ детектор
Система хроматографических данных

Требования к образцам для HPLC — анализ

Образец должен быть растворим в подвижной фазе.
Фильтрация (обычно 0,45 мкм или ниже) необходима для предотвращения засорения колонки.
Для твердых лекарственных форм применяют измельчение и экстракцию.
Количество пробы зависит от рецептуры; нескольких граммов обычно достаточно
Информация об активном ингредиенте и вспомогательном веществе должна быть предоставлена.

HPLC — анализ: продолжительность

Один прогон обычно длится от 10 до 60 минут. Благодаря тестам на пригодность системы, калибровке и повторным закачкам рутинная отчетность занимает несколько рабочих дней.

HPLC — анализ: порядок проведения

1Пробу растворяют, разбавляют и фильтруют.
2Подготовлены калибровочные стандарты.
3Проводится проверка пригодности системы, и анализ не продолжается до тех пор, пока не будут выполнены критерии.
4Пробу вводят в колонку и записывают хроматограмму.
5Пики идентифицируются по времени удерживания.
6Площади пиков оцениваются по калибровочной кривой.
7Результат подтверждается образцами контроля качества.

HPLC — анализ: критерии приёмки

Содержание активного ингредиента и пределы примесей указаны в фармакопее или регистрационном досье; в пищевой и косметической промышленности применяются соответствующие правила о добавках. Сам метод не определяет предела.

Оценка результатов

Результаты рассчитываются по калибровочной кривой. В лаборатории, где метод прошел валидацию, заранее устанавливаются линейность, извлечение, повторяемость и предел количественного определения; значение в отчете имеет смысл в пределах этого проверенного диапазона.

HPLC — анализ: протокол

Описание образца, дата получения и номер лаборатории
Примененный метод и эталонный стандарт, если таковой имеется.
Прибор и условия измерения
Этапы подготовки проб
Результаты измерений и единицы измерения
Неопределенность измерения (по запросу)
Заявление о том, что результаты относятся только к образцу, представленному на тестирование.

Аккредитация

EUROLAB имеет международно признанную аккредитацию, полученную от органов по аккредитации, являющихся участниками многосторонних соглашений о признании IAF и ILAC, в соответствии с ISO/IEC 17025 для лабораторных испытаний, ISO/IEC 17020 для инспекций и надзора, а также ISO/IEC 17021-1 и ISO/IEC 17065 для сертификации систем и продукции. Эта цепочка гарантирует, что выданные отчеты и сертификаты принимаются по всему миру.

Возможность проведения этого теста в рамках аккредитованной области зависит от вашего продукта и применяемого стандарта; поскольку аккредитация основана на методе, объем работ подтверждается в письменной форме на этапе предложения.

Область применения и разрешения

Соответствующие правила

Монографии Европейской Фармакопеи и Фармакопеи США
ЕС 1333/2008 (пищевые добавки)
Регламент ЕС 1223/2009 по косметике
ICH Q3A/Q3B (примеси)

Страницы, на которых используется этот метод

Аналитические методы — Что делает эта группа методов?

В разделе ниже описывается область, к которой относится испытание HPLC — анализ; условия и критерии приемки именно этого испытания приведены в разделах выше. Объём, специфичный для вашего продукта, подтверждается письменно на этапе коммерческого предложения.

Страницы об аналитических методах — это страницы о МЕТОДЕ ИЗМЕРЕНИЯ, а не об испытании. Это различие важно: «испытание соляным туманом» — это испытание, отвечающее на один вопрос; «ИСП-МС» — это метод, используемый в десятках различных испытаний. Иногда пользователь ищет не испытание, а метод — потому что именно название метода фигурирует в его спецификации.

Это различие становится решающим при выборе лаборатории. Когда клиент просит «анализ тяжёлых металлов», настоящий вопрос заключается в том, каким методом он будет выполнен: РФА быстр и неразрушающий, но не различает соединения; ААС экономичен для одного элемента; ИСП-АЭС определяет несколько элементов; ИСП-МС видит следовые уровни. Один и тот же образец даёт результаты с разными пределами обнаружения и разной неопределённостью в четырёх методах.

Выбор метода производится по трём критериям. ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ: находится ли искомая концентрация в диапазоне, который может определить метод? СОВМЕСТИМОСТЬ С МАТРИЦЕЙ: способен ли метод работать с матрицей образца (пластик, продукт питания, почва, металл), и требуется ли предварительная обработка? СВЯЗЬ СО СПЕЦИФИКАЦИЕЙ: требует ли стандарт на продукцию или законодательство определённого метода? Третий критерий часто перевешивает первые два — спецификация связывает метод.

Страницы методов создают ЦЕПОЧКУ. Методика связана с тестовыми страницами, на которых она используется, со стандартами, на которых основаны эти тесты, с законодательством, с которым связаны эти стандарты, и, в конечном итоге, с режимами доступа к рынку. Цепочка примеров в исходном документе работает следующим образом: РФА → анализ металлов → соответствие RoHS → ограничение содержания тяжелых металлов → страницы с покрытием. По какой бы ссылке пользователь ни перешел, он попадает и на другие.

Подготовка проб – это невидимая половина результата в этом семействе, и она является более серьезным источником ошибок, чем сама методика. Метод разложения, степень измельчения, растворитель для экстракции и степень разбавления заметно меняют результат. Один и тот же образец на одном и том же приборе дает разные результаты при разной подготовке; следовательно, определение метода охватывает и подготовку.

Калибровка и проверка являются третьим определяющим компонентом. Прибор калибруется с использованием сертифицированного эталонного материала, калибровочная кривая периодически проверяется, и в каждой партии отбирается контрольный образец. Без этих действий полученное число невозможно отследить, даже если прибор работает правильно.

Группы методов в этой области

Элементный анализ
ИСП-ОЭС, ИСП-МС, ААС и РФА. Они различаются пределом обнаружения, допуском матрицы и многоэлементной емкостью.
Хроматография
ГХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, ЖХ-МС/МС и ионная хроматография. Он разделяет смесь на компоненты и измеряет каждый отдельно.
Спектроскопия
FTIR, комбинационное рассеяние, УФ-Вид и оптическое излучение. Для идентификации материала, идентификации функциональных групп и состава сплава.
Термический анализ
ДСК, ТГА, ДМА и дилатометрия. Температуры перехода, состав, разложение и размерное поведение.
Микроскопия и визуализация
Оптическая микроскопия, SEM-EDS, рентгенография и томография. Структура, дефекты и распределение элементов.
Классическая («мокрая») химия
Титрование, гравиметрия и колориметрия. Используется в качестве эталонного метода и при подтверждении инструментальных результатов.

Часто путаемое в этой области

XRF — инструмент проверки; он видит элементы и не различает соединения. Решение об ограниченном соединении требует подтверждения методом влажной химии.
Формулировка «не обнаружено» не является доказательством отсутствия; она читается вместе с пределом обнаружения метода.
Спецификация связывает метод. Технически лучший метод не принимается, если спецификация требует другого.
Подготовка проб является частью результата; отчет, в котором не указано, что препарат не воспроизводим.
Результаты, полученные разными методами, нельзя сравнивать напрямую; их пределы обнаружения и неопределенности различаются.
Страница метода не является тестовой страницей; какой метод применяется к какому испытанию взят из стандарта на продукцию.

Какие решения подкрепляют эти результаты

Сопоставление метода из спецификации с областью аккредитации лаборатории
Выбор метода по пределу обнаружения и совместимости с матрицей
Подтверждение инструментального результата эталонным методом
Устранение отклонений, связанных с пробоподготовкой

Связанные тесты

HPLC — анализ: частые вопросы

В чем разница между ВЭЖХ и UPLC?

Основной принцип тот же. UPLC работает с насадкой из более мелких частиц и более высоким давлением; разделение завершается быстрее с более острыми пиками. Перенос возможен, если фармакопейный метод допускает замену колонки.

Почему проверка пригодности системы является обязательной?

Это показывает, что хроматографическая система в этот день с этой колонкой может достичь ожидаемого разделения. Результат, полученный без соответствия критериям, не признается действительным.