Che cos'è Endotoxin?
Il test delle endotossine misura la quantità di lipopolisaccaride (endotossina) proveniente dalla parete cellulare dei batteri Gram-negativi. L'endotossina è resistente al calore: la sterilizzazione uccide il batterio ma non distrugge l'endotossina. Un prodotto sterile può quindi essere ancora pirogeno e deve essere testato separatamente.
Scopo di Endotoxin
Lo scopo è dimostrare che il livello di endotossina nei dispositivi che entrano in contatto con il corpo attraverso il flusso sanguigno, il liquido cerebrospinale o l'impianto è inferiore al limite consentito.
A quali prodotti si applica Endotoxin?
- Cateteri endovenosi e set di infusione
- Impianti
- Set per dialisi
- Strumenti e set chirurgici
- Dispositivi a contatto con il liquido cerebrospinale
In quali settori si utilizza Endotoxin?
Norme relative a Endotoxin
- EP 2.6.14
- USP <85>
- ANSI/AAMI ST72
- ISO 11737-3
Condizioni di Endotoxin
- Metodo
- Metodi LAL gel-coagulo, turbidimetrico o cromogenico
- Estrazione
- Le superfici a contatto con il corpo del prodotto vengono estratte con acqua priva di endotossine
- Controllo delle interferenze
- È necessario verificare che il prodotto non inibisca o migliori il test
Apparecchiatura per Endotoxin
- Kit e reagenti per test LAL
- Vetreria priva di endotossine
- Lettore di micropiastre (per metodi cinetici)
- Forno a calore secco (per depirogenazione)
- Incubatrice a temperatura controllata
Requisiti del campione per Endotoxin
- Il prodotto finale sterilizzato
- La superficie di contatto con il corpo deve essere nota
- Il numero di campioni viene determinato in base alla farmacopea e alle informazioni sul lotto
- Il campione deve essere preparato e trasportato in contenitori privi di endotossine
Durata di Endotoxin
Il test iniziale, compreso lo studio sull'interferenza (inibizione/potenziamento), richiede diversi giorni; i test di routine sono più brevi.
Procedura di Endotoxin
- 1Viene calcolato il limite di endotossine per il prodotto.
- 2Viene eseguito uno studio di interferenza o viene fatto riferimento a uno studio esistente.
- 3Il prodotto viene estratto con acqua priva di endotossine.
- 4L'estratto viene miscelato con il reagente LAL.
- 5Viene incubato alla temperatura definita.
- 6A seconda del metodo vengono misurati la formazione di coaguli, la torbidità o lo sviluppo del colore.
- 7La quantità di endotossina viene calcolata dalla curva standard.
Criteri di accettazione di Endotoxin
Il criterio di accettazione è il limite di endotossine calcolato per il prodotto. Tale limite viene calcolato utilizzando la formula definita nella farmacopea, in base alla via di contatto del dispositivo e al peso del paziente; il limite è nettamente inferiore per i dispositivi a contatto con il liquido cerebrospinale.
Valutazione dei risultati
Il risultato viene confrontato con il limite calcolato. Se lo studio dell'interferenza non è valido, il risultato non può essere interpretato; laddove il prodotto sopprime la reazione LAL, è necessario determinare un fattore di diluizione.
Rapporto di Endotoxin
- Farmacopea applicata e metodo
- Descrizione del campione, lotto e superficie
- Limite di endotossine calcolato
- Risultato dello studio sull'interferenza e fattore di diluizione
- Valore di endotossina misurato (EU/dispositivo o EU/mL)
- Confronto con il limite
Accreditamento
EUROLAB detiene un accreditamento riconosciuto a livello internazionale ottenuto da organismi di accreditamento parte degli accordi di riconoscimento multilaterale IAF e ILAC, secondo ISO / IEC 17025 per prove di laboratorio, ISO / IEC 17020 per ispezione e sorveglianza e ISO / IEC 17021-1 e ISO / IEC 17065 per certificazione di sistema e prodotto. Questa catena garantisce che i rapporti e i certificati emessi siano accettati in tutto il mondo.
Se questo test può essere offerto nell'ambito accreditato dipende dal prodotto e dallo standard applicato; poiché l'accreditamento è basato sul metodo, l'ambito viene confermato per iscritto in fase di offerta.
Ambito e autorizzazioniRegolamenti correlati
- MDR (UE) 2017/745
- Requisiti della farmacopea
Analisi farmaceutica — Cosa copre questo ambito di prova?
La sezione seguente descrive l'ambito a cui appartiene la prova Endotoxin; le condizioni e i criteri di accettazione di questa prova specifica sono riportati nelle sezioni precedenti. L'ambito specifico del vostro prodotto viene confermato per iscritto in fase di offerta.
L'analisi farmaceutica determina l'identità, la purezza, la quantità e il comportamento del principio attivo del medicinale e del prodotto finito. Ciò che contraddistingue questa disciplina dalle altre è il fatto che i metodi sono in gran parte definiti nelle FARMACOPEE: la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) e la Farmacopea degli Stati Uniti (USP) forniscono sia il metodo che il quadro di riferimento per l'accettazione.
Il carattere vincolante del metodo della farmacopea determina le modalità operative del settore. Mentre in altri settori il laboratorio può scegliere un metodo adeguato, in questo caso è fondamentale attenersi al metodo indicato nella monografia; se si intende utilizzare un metodo alternativo, è necessario dimostrarne l'equivalenza. Ciò garantisce che i risultati siano comparabili a livello mondiale.
Le analisi vengono condotte in diversi gruppi. L'identificazione e la determinazione quantitativa (HPLC, UV, titolazione) indicano la natura del prodotto e la quantità di principio attivo in esso contenuta. Il profilo di impurità e i residui di solventi individuano i composti indesiderati derivanti dal processo di produzione. Le impurità elementari riguardano i metalli provenienti dai catalizzatori e dalle attrezzature. Il comportamento di dissoluzione e dispersione costituisce il principale indicatore in vitro relativo al comportamento di rilascio del farmaco nell'organismo.
L'ESPERIMENTO DI DISCIOLUZIONE è una delle misurazioni più critiche in questo campo. Non è sufficiente che una compressa contenga la giusta quantità di principio attivo; tale sostanza deve disciogliersi alla velocità adeguata. Il profilo di dissoluzione viene utilizzato per valutare l'effetto delle modifiche alla formulazione sulla biodisponibilità e riveste un ruolo centrale nell'autorizzazione all'immissione in commercio dei farmaci generici.
La CONVALIDA DEL METODO è una fase obbligatoria in questa famiglia. Se si utilizza un metodo della Farmacopea, si verifica che il metodo funzioni correttamente nelle condizioni specifiche di quel laboratorio. Se è stato sviluppato un metodo proprio, questo viene convalidato in base a parametri quali linearità, precisione, accuratezza, selettività, limiti di rilevabilità e di determinazione, nonché robustezza. I risultati ottenuti con un metodo non convalidato non possono essere utilizzati nel fascicolo di autorizzazione.
I test di stabilità determinano la durata di conservazione e rappresentano l'attività più lunga in questo settore. Il prodotto viene lasciato a riposo in condizioni di temperatura e umidità specificate, viene analizzato a intervalli regolari e i risultati costituiscono la base per la dichiarazione relativa alla durata di conservazione e alle condizioni di conservazione. Le condizioni accelerate forniscono informazioni preliminari, ma i dati in tempo reale sono fondamentali.
L'aspetto microbiologico costituisce un ambito a sé stante: conteggio della carica microbica, ricerca di microrganismi specifici, prova di sterilità sui prodotti sterili e prova delle endotossine batteriche. Per i prodotti sterili entrano in gioco anche la verifica dell'integrità della confezione e la convalida della sterilizzazione.
L'integrità dei dati si è spostata al centro delle ispezioni negli ultimi anni. Non basta che il risultato sia corretto; i dati grezzi devono essere tracciabili, inalterabili e verificabili. La convalida dei sistemi di registrazione elettronica è quindi diventata una parte inseparabile dell'analisi.
Gruppi di metodi in questo ambito
Identità e dosaggio
HPLC, UPLC, spettrofotometria UV-Vis, titolazione, conferma dell'identità mediante FTIR.
Impurezze e residui
Impurezze correlate, prodotti di degradazione, solventi residui (GC-headspace), screening delle nitrosammine.
Impurezze elementari
Determinazione delle impurezze elementari mediante ICP-MS e ICP-OES e relativa valutazione del rischio.
Fisico-chimico
Dissoluzione e disgregazione, durezza, friabilità, uniformità delle unità di dosaggio, contenuto d'acqua (Karl Fischer), dimensione delle particelle.
Microbiologico
Conta microbica, microrganismi specificati, sterilità, endotossina batterica, efficacia del conservante.
Stabilità
Studi di stabilità in tempo reale e accelerata; fotostabilità e stabilità in uso.
Confusioni frequenti in questo ambito
- Il metodo farmacopeico è vincolante; un metodo alternativo può essere usato solo dimostrandone l'equivalenza.
- Un risultato prodotto senza convalida del metodo non può essere utilizzato in un dossier di registrazione.
- La stabilità accelerata non sostituisce i dati in tempo reale; la shelf-life è supportata da risultati in tempo reale.
- Il profilo di dissoluzione è sensibile al tipo di apparecchio, alla velocità di agitazione e al mezzo; le condizioni devono essere complete nel rapporto.
- Una carenza nell'integrità dei dati produce una non conformità in un'ispezione anche se il risultato è corretto.
- Una modifica della formulazione o del fornitore richiede un confronto analitico e, se necessario, un nuovo studio di stabilità.
Quali decisioni supportano questi risultati
- Il dossier di registrazione e il rilascio dei lotti
- Determinazione della shelf-life e delle condizioni di conservazione
- Trasferimento del metodo e convalida del metodo
- Controllo di accettazione delle materie prime in ingresso dai fornitori
- Valutazione dell'effetto di una modifica della formulazione sulla bioequivalenza
Test correlati
Domande frequenti su Endotoxin
Il mio prodotto è sterile: perché è necessario un test delle endotossine?
L'endotossina è resistente al calore; sebbene la sterilizzazione uccida il batterio, non distrugge l'endotossina, che è un residuo della parete cellulare. Un prodotto sterile può quindi comunque provocare una reazione pirogenica e l'endotossina deve essere misurata separatamente.
Come viene determinato il limite delle endotossine?
Si calcola utilizzando la formula definita nella farmacopea, in base alla via di contatto del dispositivo e alla dose consentita. Per i dispositivi a contatto con il liquido cerebrospinale il limite è molto più basso; il calcolo deve essere riportato nel verbale.