HPLC Analizi | EUROLAB

HPLC Analizi Nedir?

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, numunenin bir sıvı hareketli faz ile basınç altında dolgulu kolondan geçirilmesi esasına dayanır. Bileşenler durgun faza olan ilgilerine göre farklı hızlarda ilerler ve kolonu farklı zamanlarda terk eder; UV, DAD, floresans veya kırılma indisi dedektörü ile ölçülür.

HPLC Analizi Amacı

Amaç, ısıl olarak kararsız veya uçucu olmayan bileşikleri bozmadan ayırmak ve miktarını belirlemektir. İlaçta etken madde tayini ve safsızlık profili, gıdada katkı ve vitamin tayini bu teknikle yapılır.

HPLC Analizi Hangi Ürünlere Uygulanır?

İlaç etken maddeleri ve bitmiş ürünler
Gıda katkı maddeleri, koruyucular ve tatlandırıcılar
Vitamin preparatları ve takviyeler
Kozmetik ürünlerde koruyucu ve UV filtreleri
Polimer katkıları ve antioksidanlar

HPLC Analizi Hangi Sektörlerde Kullanılır?

KimyaİlaçGıdaKozmetikÇevreBiyoteknolojiPerakende

HPLC Analizi İçin İlgili Standartlar

Avrupa Farmakopesi (Ph. Eur.) genel bölüm 2.2.29 — sıvı kromatografisi
USP <621> (kromatografi)
ICH Q2(R2) (analitik yöntem validasyonu)
EN 12856 / EN 12857 (gıdada tatlandırıcı ve katkı tayini)

HPLC Analizi Koşulları

Kolon: Yöntem standardında tanımlı dolgu ve boyut
Hareketli faz: Yöntemde tanımlı tampon/organik çözücü oranı; izokratik veya gradyan
Dedektör dalga boyu: Analitin absorpsiyon maksimumuna göre yöntemde belirtilir
Sistem uygunluğu: Farmakopede tanımlı çözünürlük, kuyruklanma ve tekrarlanabilirlik ölçütleri

HPLC Analizi Cihazı

Yüksek basınç pompası ve gradyan ünitesi
Otomatik enjektör
Kolon fırını ve analitik kolonlar
UV / DAD / floresans / RI dedektörü
Kromatografi veri sistemi

HPLC Analizi İçin Numune Gereksinimleri

Numune hareketli fazda çözünür hâle getirilmeli
Kolon tıkanmasını önlemek için süzme (genellikle 0,45 µm veya altı) gerekir
Katı dozaj formlarında öğütme ve ekstraksiyon uygulanır
Numune miktarı formülasyona göre değişir; birkaç gram genellikle yeterlidir
Etken madde ve yardımcı madde bilgisi paylaşılmalı

HPLC Analizi Süresi

Tek bir koşu genellikle 10–60 dakika arasındadır. Sistem uygunluk testleri, kalibrasyon ve tekrarlı enjeksiyonlarla birlikte rutin raporlama birkaç iş günü sürer.

HPLC Analizi Prosedürü

1Numune çözülür, seyreltilir ve süzülür.
2Kalibrasyon standartları hazırlanır.
3Sistem uygunluk testi yapılır ve ölçütler sağlanana kadar analize geçilmez.
4Numune kolona enjekte edilir ve kromatogram kaydedilir.
5Pikler alıkonma zamanına göre tanımlanır.
6Pik alanları kalibrasyon eğrisine göre değerlendirilir.
7Kalite kontrol numuneleri ile sonuç doğrulanır.

HPLC Analizi Kabul Kriterleri

Etken madde miktarı ve safsızlık sınırları farmakopeden veya ruhsat dosyasından gelir; gıda ve kozmetikte ilgili katkı mevzuatı belirler. Yöntemin kendisi sınır tanımlamaz.

Sonuçların Değerlendirilmesi

Sonuçlar kalibrasyon eğrisi üzerinden hesaplanır. Yöntem doğrulaması yapılmış bir laboratuvarda doğrusallık, geri kazanım, tekrarlanabilirlik ve tayin sınırı önceden belirlenir; rapordaki değer bu doğrulanmış aralık içinde anlamlıdır.

HPLC Analizi Raporu

Numune tanımı, geliş tarihi ve laboratuvar numarası
Uygulanan yöntem ve varsa referans standardı
Cihaz ve ölçüm koşulları
Numune hazırlama basamakları
Ölçüm sonuçları ve birimleri
Ölçüm belirsizliği (talep edilmişse)
Sonuçların yalnızca deneye sunulan numuneye ait olduğu beyanı

Akreditasyon

EUROLAB; laboratuvar deneylerinde ISO/IEC 17025, muayene ve gözetimde ISO/IEC 17020, sistem ve ürün belgelendirmesinde ISO/IEC 17021-1 ve ISO/IEC 17065 kapsamlarında, IAF ve ILAC çok taraflı tanınma anlaşmalarına taraf akreditasyon kuruluşlarından alınmış uluslararası tanınan akreditasyona sahiptir. Bu zincir, düzenlenen rapor ve belgelerin dünya genelinde kabul görmesini sağlar.

Bu testin akredite kapsamda sunulup sunulamayacağı ürününüze ve uygulanacak standarda göre değişir; akreditasyon metot bazında olduğu için kapsam teklif aşamasında yazılı olarak teyit edilir.

Kapsam ve yetkiler

İlgili Mevzuat

Avrupa Farmakopesi ve USP monografları
AB 1333/2008 (gıda katkı maddeleri)
AB 1223/2009 Kozmetik Tüzüğü
ICH Q3A / Q3B (safsızlıklar)

Bu Yöntemin Kullanıldığı Sayfalar

Analiz Yöntemleri — Bu Yöntem Grubu Ne Yapar?

Aşağıdaki bölüm HPLC Analizi deneyinin ait olduğu alanı anlatır; bu deneyin kendi koşulları ve kabul ölçütleri yukarıdaki bölümlerde yer alır. Ürününüze özgü kapsam teklif aşamasında yazılı olarak netleştirilir.

Analiz yöntemi sayfaları, bir deneyin değil bir ÖLÇÜM TEKNİĞİNİN sayfasıdır. Fark önemlidir: "tuz sisi testi" bir deneydir ve bir soruyu yanıtlar; "ICP-MS" bir tekniktir ve onlarca farklı deneyde kullanılır. Kullanıcı bazen deneyi değil tekniği arar — çünkü şartnamesinde yöntem adı yazılıdır.

Bu ayrım laboratuvar seçiminde belirleyici olur. Bir müşteri "ağır metal analizi" istediğinde asıl soru hangi teknikle yapılacağıdır: XRF hızlı ve tahribatsızdır ama bileşik ayırt etmez; AAS tek element için ekonomiktir; ICP-OES çoklu element tarar; ICP-MS eser miktarları görür. Aynı numune dört teknikte farklı tespit sınırı ve farklı belirsizlikle sonuç verir.

Yöntem seçimi üç ölçüte göre yapılır. TESPİT SINIRI: aranan derişim yöntemin görebileceği aralıkta mı? MATRİS UYUMU: numune matrisi (plastik, gıda, toprak, metal) yöntemin çalışabileceği türde mi, ön işlem gerekiyor mu? ŞARTNAME BAĞI: ürün standardı ya da mevzuat belirli bir yöntemi zorunlu kılıyor mu? Üçüncüsü çoğu zaman ilk ikisini geçersiz kılar — şartname yöntemi bağlar.

Yöntem sayfaları ZİNCİR kurar. Bir teknik, kullanıldığı test sayfalarına, o testlerin dayandığı standartlara, o standartların bağlı olduğu mevzuata ve nihayetinde pazar erişim rejimlerine bağlanır. Dokümandaki örnek zincir şöyle işler: XRF → metal analizi → RoHS uygunluğu → ağır metal kısıtlaması → kaplama sayfaları. Kullanıcı hangi halkadan girerse girsin diğerlerine ulaşır.

Numune hazırlığı bu ailede sonucun görünmeyen yarısıdır ve tekniğin kendisinden daha fazla hata kaynağıdır. Çözündürme yöntemi, öğütme derecesi, ekstraksiyon çözücüsü ve seyreltme oranı sonucu belirgin biçimde değiştirir. Aynı cihazda aynı numune, farklı hazırlıkla farklı sonuç verir; bu yüzden yöntem tanımı hazırlığı da kapsar.

Kalibrasyon ve doğrulama üçüncü belirleyici bileşendir. Bir cihaz sertifikalı referans malzemeyle kalibre edilir, kalibrasyon eğrisi periyodik olarak doğrulanır ve her seride kontrol numunesi çalıştırılır. Bu adımlar olmadan üretilen bir sayı, cihaz doğru çalışıyor olsa bile izlenebilir değildir.

Bu alanın yöntem grupları

Element analizi
ICP-OES, ICP-MS, AAS ve XRF. Tespit sınırı, matris toleransı ve çoklu element kapasitesi bakımından ayrışırlar.
Kromatografi
GC, GC-MS, HPLC, LC-MS/MS ve iyon kromatografisi. Karışımı bileşenlerine ayırır ve her bileşeni ayrı ölçer.
Spektroskopi
FTIR, Raman, UV-Vis ve optik emisyon. Malzeme kimliği, fonksiyonel grup tanımlaması ve alaşım bileşimi için.
Termal analiz
DSC, TGA, DMA ve dilatometri. Geçiş sıcaklıkları, bileşim, bozunma ve boyutsal davranış.
Mikroskopi ve görüntüleme
Optik mikroskopi, SEM-EDS, radyografi ve tomografi. Yapı, kusur ve elementel dağılım.
Klasik (ıslak) kimya
Titrasyon, gravimetri ve kolorimetri. Referans yöntem olarak ve enstrümantal sonuçların doğrulanmasında kullanılır.

Bu alanda sık karıştırılanlar

XRF bir tarama aracıdır; element görür, bileşik ayırt etmez. Kısıtlı bileşik kararı için ıslak kimya ile doğrulama gerekir.
"Tespit edilmedi" ifadesi yokluk kanıtı değildir; yöntemin tespit sınırıyla birlikte okunur.
Şartname yöntemi bağlar. Teknik olarak daha iyi bir yöntem, şartname başkasını istiyorsa kabul edilmez.
Numune hazırlığı sonucun parçasıdır; hazırlık yazılmayan bir rapor tekrarlanabilir değildir.
Farklı tekniklerle alınmış sonuçlar birebir karşılaştırılamaz; tespit sınırları ve belirsizlikleri farklıdır.
Yöntem sayfası bir deney sayfası değildir; hangi deney için hangi yöntemin uygulanacağı ürün standardından gelir.

Bu alandaki sonuçlar hangi kararı besler

Şartnamede yazan yöntemin laboratuvar kapsamıyla eşleştirilmesi
Tespit sınırı ve matris uyumuna göre yöntem seçimi
Enstrümantal sonucun referans yöntemle doğrulanması
Numune hazırlığı kaynaklı sapmaların giderilmesi

İlgili Testler

HPLC Analizi Hakkında Sık Sorulan Sorular

HPLC ile UPLC arasındaki fark nedir?

Temel ilke aynıdır. UPLC daha küçük tanecikli dolgu ve daha yüksek basınçla çalışır; ayrım daha kısa sürede ve daha keskin piklerle tamamlanır. Farmakope yöntemleri kolon değişimine izin veriyorsa aktarım yapılabilir.

Sistem uygunluk testi neden zorunlu?

Kromatografik sistemin o gün, o kolonla beklenen ayırmayı yapabildiğini gösterir. Ölçütler sağlanmadan alınan sonuç geçerli kabul edilmez.