Qu'est-ce que HPLC — analyse ?
La chromatographie liquide haute performance consiste à faire passer l'échantillon à travers une colonne remplie sous pression avec une phase mobile liquide. Les composants se déplacent à des vitesses différentes selon leur affinité pour la phase stationnaire et quittent la colonne à des moments différents ; ils sont mesurés avec un détecteur UV, DAD, à fluorescence ou à indice de réfraction.
Objectif de HPLC — analyse
Le but est de séparer des composés thermiquement labiles ou non volatils sans les dégrader et d'en déterminer la quantité. Le dosage des ingrédients actifs et le profilage des impuretés dans les produits pharmaceutiques, ainsi que la détermination des additifs et des vitamines dans les aliments, sont effectués avec cette technique.
À quels produits HPLC — analyse s'applique-t-il ?
- Principes actifs pharmaceutiques et produits finis
- Additifs alimentaires, conservateurs et édulcorants
- Préparations et suppléments de vitamines
- Conservateurs et filtres UV dans les produits cosmétiques
- Additifs polymères et antioxydants
Dans quels secteurs HPLC — analyse est-il utilisé ?
Normes relatives à HPLC — analyse
- Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) chapitre général 2.2.29 — chromatographie liquide
- USP <621> (chromatographie)
- ICH Q2(R2) (validation des procédures analytiques)
- EN 12856 / EN 12857 (détermination des édulcorants et additifs dans les aliments)
Conditions de HPLC — analyse
- Kolon
- Remplissage et taille définis dans la norme de méthode
- Hareketli faz
- Rapport tampon/solvant organique défini dans la méthode ; isocratique ou dégradé
- Longueur d'onde du détecteur
- Il est précisé dans la méthode en fonction du maximum d'absorption de l'analyte
- Adéquation du système
- Critères de solubilité, de traînée et de reproductibilité définis dans la pharmacopée
Équipement pour HPLC — analyse
- Pompe haute pression et unité de gradient
- Échantillonneur automatique
- Four à colonnes et colonnes analytiques
- Détecteur UV / DAD / fluorescence / RI
- Système de données de chromatographie
Exigences d'échantillon pour HPLC — analyse
- L'échantillon doit être rendu soluble dans la phase mobile
- Une filtration (généralement 0,45 µm ou moins) est nécessaire pour éviter le colmatage de la colonne
- Le broyage et l’extraction sont appliqués aux formes galéniques solides
- La quantité d’échantillon varie selon la formulation ; quelques grammes suffisent généralement
- Les informations sur les ingrédients actifs et les excipients doivent être partagées
Durée de HPLC — analyse
Une seule exécution dure généralement entre 10 et 60 minutes. Avec les tests d'adéquation du système, l'étalonnage et les injections répétées, les rapports de routine prennent quelques jours ouvrables.
Procédure de HPLC — analyse
- 1L'échantillon est dissous, dilué et filtré.
- 2Des étalons d'étalonnage sont préparés.
- 3Un test d'adéquation du système est effectué et l'analyse ne se poursuit que lorsque les critères sont remplis.
- 4L'échantillon est injecté sur la colonne et le chromatogramme est enregistré.
- 5Les pics sont identifiés par le temps de rétention.
- 6Les zones de pics sont évaluées selon la courbe d'étalonnage.
- 7Le résultat est vérifié avec des échantillons de contrôle qualité.
Critères d'acceptation de HPLC — analyse
La teneur en principes actifs et les limites d'impuretés proviennent de la pharmacopée ou du dossier d'enregistrement ; dans les produits alimentaires et cosmétiques, la réglementation correspondante sur les additifs s'applique. La méthode elle-même ne définit pas de limite.
Évaluation des résultats
Les résultats sont calculés à partir de la courbe d'étalonnage. Dans un laboratoire où la méthode a été validée, la linéarité, la récupération, la répétabilité et la limite de quantification sont établies au préalable ; la valeur dans le rapport est significative dans cette plage validée.
Rapport de HPLC — analyse
- Description de l'échantillon, date de réception et numéro de laboratoire
- Méthode appliquée et étalon de référence, le cas échéant
- Conditions d’instrument et de mesure
- Étapes de préparation des échantillons
- Résultats et unités de mesure
- Incertitude de mesure (si demandé)
- Une déclaration selon laquelle les résultats concernent uniquement l'échantillon soumis pour test
Accréditation
EUROLAB détient une accréditation internationalement reconnue obtenue auprès des organismes d'accréditation parties aux accords de reconnaissance multilatérale de l'IAF et de l'ILAC, selon ISO/IEC 17025 pour les tests en laboratoire, ISO/IEC 17020 pour l'inspection et la surveillance, et ISO/IEC 17021-1 et ISO/IEC 17065 pour la certification des systèmes et des produits. Cette chaîne garantit que les rapports et certificats délivrés sont acceptés dans le monde entier.
La possibilité de proposer ce test dans le cadre d'une accréditation dépend de votre produit et de la norme appliquée ; l'accréditation étant méthodologique, le périmètre est confirmé par écrit au stade du devis.
Portée et autorisationsRèglements connexes
- Monographies de la Pharmacopée européenne et de l'USP
- UE 1333/2008 (additifs alimentaires)
- Règlement Cosmétiques UE 1223/2009
- ICH Q3A / Q3B (impuretés)
Pages où cette méthode est utilisée
Méthodes d'analyse — Que fait ce groupe de méthodes ?
La section ci-dessous décrit le domaine auquel appartient l'essai HPLC — analyse ; les conditions et critères d'acceptation de cet essai figurent dans les sections ci-dessus. Le périmètre propre à votre produit est confirmé par écrit au stade du devis.
Les pages sur les méthodes analytiques sont des pages consacrées à une TECHNIQUE DE MESURE plutôt qu'à un essai. Cette différence compte : « l'essai au brouillard salin » est un essai et répond à une question ; « ICP-MS » est une technique et s'utilise dans des dizaines d'essais différents. Parfois, l'utilisateur ne recherche pas l'essai mais la technique — car c'est le nom de la méthode qui figure dans son cahier des charges.
Cette distinction devient déterminante dans le choix d'un laboratoire. Lorsqu'un client demande une « analyse des métaux lourds », la vraie question est de savoir par quelle technique elle sera réalisée : la XRF est rapide et non destructive mais ne distingue pas les composés ; l'AAS est économique pour un seul élément ; l'ICP-OES analyse plusieurs éléments ; l'ICP-MS détecte des niveaux de trace. Le même échantillon donne des résultats avec des limites de détection et des incertitudes différentes selon les quatre techniques.
Le choix de la méthode se fait selon trois critères. LIMITE DE DÉTECTION : la concentration recherchée est-elle dans la plage que la méthode peut détecter ? COMPATIBILITÉ DE MATRICE : la matrice de l'échantillon (plastique, aliment, sol, métal) est-elle une que la méthode peut traiter, et un prétraitement est-il nécessaire ? LIEN AVEC LE CAHIER DES CHARGES : la norme produit ou la législation impose-t-elle une méthode particulière ? Le troisième critère l'emporte souvent sur les deux premiers — le cahier des charges impose la méthode.
Les pages de méthodes construisent une CHAÎNE. Une technique est liée aux pages de test sur lesquelles elle est utilisée, aux normes sur lesquelles reposent ces tests, à la législation à laquelle ces normes sont liées et, en fin de compte, aux régimes d'accès au marché. La chaîne d'exemples dans le document source fonctionne comme ceci : XRF → analyse des métaux → conformité RoHS → restriction sur les métaux lourds → pages de revêtement. Quel que soit le lien à partir duquel l’utilisateur entre, il atteint les autres.
La préparation des échantillons est la moitié invisible du résultat dans cette famille et constitue une source d’erreur plus importante que la technique elle-même. La méthode de digestion, le degré de broyage, le solvant d'extraction et le taux de dilution modifient considérablement le résultat. Le même échantillon sur le même instrument donne un résultat différent avec une préparation différente ; la définition de la méthode couvre donc également la préparation.
L'étalonnage et la vérification sont le troisième élément déterminant. Un instrument est calibré avec un matériau de référence certifié, la courbe d'étalonnage est vérifiée périodiquement et un échantillon de contrôle est analysé dans chaque lot. Sans ces étapes, un numéro produit n'est pas traçable même si l'instrument fonctionne correctement.
Groupes de méthodes dans ce domaine
Analyse élémentaire
ICP-OES, ICP-MS, AAS et XRF. Ils diffèrent par la limite de détection, la tolérance matricielle et la capacité multi-éléments.
Chromatographie
GC, GC-MS, HPLC, LC-MS/MS et chromatographie ionique. Il sépare un mélange en ses composants et mesure chacun séparément.
Spectroscopie
FTIR, Raman, UV-Vis et émission optique. Pour l’identité des matériaux, l’identification des groupes fonctionnels et la composition de l’alliage.
Analyse thermique
DSC, TGA, DMA et dilatométrie. Températures de transition, composition, décomposition et comportement dimensionnel.
Microscopie et imagerie
Microscopie optique, SEM-EDS, radiographie et tomographie. Structure, défauts et distribution élémentaire.
Chimie classique (par voie humide)
Titrage, gravimétrie et colorimétrie. Utilisé comme méthode de référence et pour confirmer les résultats instrumentaux.
Confusions fréquentes dans ce domaine
- XRF est un outil de dépistage ; il voit les éléments et ne distingue pas les composés. Une décision concernant un composé restreint nécessite une confirmation par chimie humide.
- L'expression « non détecté » n'est pas une preuve d'absence ; elle se lit avec la limite de détection de la méthode.
- La spécification lie la méthode. Une méthode techniquement meilleure n’est pas acceptée si la spécification en appelle une autre.
- La préparation des échantillons fait partie du résultat ; un rapport qui ne mentionne pas la préparation n'est pas reproductible.
- Les résultats obtenus par différentes techniques ne peuvent pas être comparés directement ; leurs limites de détection et leurs incertitudes diffèrent.
- Une page de méthode n’est pas une page de test ; quelle méthode s'applique à quel test provient de la norme de produit.
Quelles décisions ces résultats étayent
- Faire correspondre la méthode du cahier des charges au périmètre du laboratoire
- Choix de la méthode selon la limite de détection et la compatibilité matricielle
- Confirmation d'un résultat instrumental par une méthode de référence
- Élimination des écarts liés à la préparation des échantillons
Tests associés
Questions fréquentes sur HPLC — analyse
Quelle est la différence entre HPLC et UPLC ?
Le principe de base est le même. L'UPLC fonctionne avec un garnissage de particules plus petites et une pression plus élevée ; la séparation est réalisée plus rapidement avec des pics plus nets. Le transfert est possible si la méthode pharmacopée permet un changement de colonne.
Pourquoi un test d’adéquation du système est-il obligatoire ?
Cela montre que le système chromatographique, ce jour-là, avec cette colonne, peut réaliser la séparation attendue. Un résultat obtenu sans répondre aux critères n’est pas accepté comme valide.